岡山県立岡山操山高等学校

岡山操山中学校 通信制課程
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形質転換 その2

結果(可視光線)

結果(UV照射)

結果

結果の一例を表示します。
培養条件:37℃ 培養期間:3~4日

(A)  +DNA  LB/amp (B)  +DNA   LB/amp/ara
   コロニ- 346個  蛍光  無    コロニ- 440個  蛍光  有
(C)  -DNA  LB/amp  (D)  -DNA  LB
   コロニ- 0個  蛍光  無    コロニ-  ∞個 
  蛍光  無

実験を成功させるためのポイント

  1. 実験前
    • 形質転換用溶液(Bu),LB培地,プラスミド溶液は氷冷しておく。
  2. 実験中
    • 各操作段階で,大腸菌の状態を把握しておく。
    • 植付け用ループやピペットの取り換えに注意する。
    • ヒートショックの時間を厳密に計る。
    • 大腸菌の状態を考え,タッピングをむやみに行わない
  3. 実験後
    • 使用した器具・試薬の処理を厳密に行う。
    • 実験終了後は,手・机上をアルコール消毒する。

トラブルシューティング

  • 白衣の着用。
  • 実験前後には,手を70%エタノールで消毒する。この時実験台も拭き,それが乾いてから実験を開始する。
  • チューブの持ち方,ループやピペットの取り出し方など,器具の取扱いに気をつける。
  • 使用した使い捨て器具・試薬は机の上などに置かず,所定のゴミバックに入れる。大腸菌に触れなかったものは普通ゴミとして処分する。
  • 皮膚や衣類が,万が一大腸菌に触れた場合は70%エタノールで殺菌して,水で洗い流す。
  • 実験室の扉・窓は閉じておく。

用語解説

  • DNAリガーゼ:組み込んだDNAを組み込まれたDNAと結合させる酵素。
  • Green Fluorescent Protein:Green Fluorescent Protein(GFP)は生物蛍光を発するオワンクラゲ、Aequreavictoriaから単離されたタンパク質です。GFP遺伝子は最近になってクローン化されました。特徴的な構造ゆえに、紫外線を照射するとそのエネルギーを吸収し、吸収されたエネルギーは緑色のきれいな光となって放出されます。
  • pGLO:GFP遺伝子とアンピシリン耐性であるβ-ラクタマ-ゼ遺伝子を含むプラスミド。
  • アラビノース:甘味料の1種。バクテリアが通常食物として利用する。
  • アンピシリン:抗生物質の1種。
  • 形質転換用緩衝液 :形質転換用緩衝液 (50mM CaCl2、pH7.4)中のCa2+イオンがDNA(plasmid)の負電荷(リン酸基を持つため)を中和し、同じく負電荷を持つ、細胞膜のリン脂質との静電的反発をやわらげます。そして、DNAは細胞膜の外側から内側に通り抜けることができるのです。
  • コロニー:寒天培地上で生育した、同じ遺伝子を持つ細胞の凝集塊。一つのコロニーにあるすべての細胞は同じ遺伝子を持つので、クローンと呼ばれます。
  • 培地:液体や寒天(LB)培地は,バクテリアの生育をサポートする固形物質。炭水化物やアミノ酸、ヌクレオチド、無機塩類、ビタミンを含みます。
  • ヒートショック:ヒートショックを与えることにより、DNAの細胞膜を通り抜ける割合が増加します。細胞の種類により異なります。
  • プラスミド:細菌などに存在する主のDNAとは別のDNA。環状のDNAで、自己複製ができます。抗生物質耐性タンパク質やGFPのようなクローン化された他の生物の遺伝子を組み込むことがでます。
  • ベクター:運び屋DNA。今回のプラスミドのように、他の生物からのDNA断片を組み込まれ、宿主となる細胞に導入される、自己複製するDNA分子

ピペットの説明

ピペット:使い捨てピペットは,減菌した状態で1本ずつ袋に入っている。直前に袋から出し使用する。100μL~1mLを採集できる。

ループの使い方

  • ループは,減菌した状態で袋に入っている。直前に袋から出し使用する。
  • 菌を塗布するときは,ループ先の輪の部分を培地表面と平衡に滑らせるように,手早くプレート表面をできるだけ広範囲に広げる(上右図)。

コロニーの数え方

  • 裏返して数える。
  • コロニー数が多い場合,4等分(8等分)してサインペンでマークしていく。それぞれ30~50個までは数えられ,4倍(8倍)する。
  • 上右端図のように全面に生えている場合は∞とする。