形質転換 その１
目 的
大腸菌にオワンクラゲの遺伝子を導入し，蛍光発光させる。
準 備
| 材 料 | BIO-RAD「Biotechnology Explorerキッド」 | |
| 器 具 | ウオーターバス(42℃)・インキュベーター(37℃)・油性ペン ・ピペット・植付け用ループ・緑と青のチューブ・チューブ立て(キッドに同包) |
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| 薬 品 | ・大腸菌スタータープレート(LB) 1枚・pGLOプラスミド溶液 1本 ・寒天培地(LB×1 LB/amp×2 LB/amp/ara×1) 計4枚・形質転換用溶液(Bu) 1本 ・LB培地(液体) 1本 |
実験材料
材料は，氷冷しておきます。
寒天培地
次の4枚をあらかじめ用意しておきます。
| (A) +DNA LB/amp | (B) +DNA LB?amp?ara |
| (C) -DNA LB/amp | (D) -DNA LB |
実験器具(1)
マーカー以外はキッドに同包されたものを使用します。
実験器具(2)
遺伝子組み換えの基本
- 導入したい遺伝子を制限酵素の作用を使って切り出す。
- プラスミドを１と同じ制限酵素で切り出す。
- 導入したい遺伝子とプラスミドをリカーゼの作用を使って結合させる。
- プラスミドを目的の生物の細胞に取り込ませる。
- 遺伝子を組み換えた細胞を培養して目的物質を生産させる。
遺伝子組み換えの原理
イラストで説明してます。 原理１・原理２ (クリックしてください，別画面で開きます。)
実験手順
１．緑チューブのフタに「＋DNA」，青チューブのフタに「－DNA」と記入する。
| ここでのDNAはプラスミドのことです。 |
２．緑と青チューブに形質転換溶液(Bu)を250μℓずつ加え，冷却する(両方同じピペットを使用できる)。
| 両方同じピペットを使用する。 |
３．形質転換される大腸菌を緑と青チューブに溶解させ，冷却する。
| 大腸菌スタータープレート（LB）のコロニーを植付け用ループですくい取り，緑チューブに溶かし入れる。青いチューブも同様に行う。 |
| 大腸菌を溶かし入れたら，液層に触らないこと。 温めないようにする。 |
４．pGLOプラスミド溶液を緑（＋）チューブのみに加える。
| 新しい植付け用ループをpGLOプラスミド溶液に浸し，○部分に膜が張っていることを確認して，緑チューブに浸し，攪拌する。 |
| pGLOプラスミドは，オワンクラゲの蛍光発色遺伝子を導入させるベクター。 |
５．緑と青チューブを10分間冷水につける。
６．寒天培地４枚のフタに次のサンプル名を記入する。
| それぞれにA+ B+ C- D-と記入する。 |
７．ヒートショック：冷却による遺伝子の導入
| 緑・青チューブをチューブ立てに立て，ウオーターバス（42℃）に，50秒浸ける。 50秒後すぐに，氷に戻し2分間冷やす。温度変化により，DNAを閉じ込める。 |
| DNAの細胞膜を通り抜ける割合を増加させている。 |
８．氷中から緑・青チューブを取り出し，LB培地（液体）をそれぞれ250μLずつ加える。
| 緑・青チューブの中身は全く異なるものになっている。 LB培地を加えるときは別々のピペットを使用する。 |
| ヒートショックで弱った大腸菌に栄養を与える。 |
9．10分間室温で放置する。
10．形質転換した大腸菌を培地に移し，培養する。
| 緑・青チューブをタッピングして溶液を混合する。 （大腸菌がチューブ内に沈んでいるため） |
| 各チューブの大腸菌を以下のように各培地に滴下する。 |
| 【緑チューブ（＋DNA）】 LB/amp （A） LB/amp/ara （B） |
【青チューブ（－DNA）】 LB （C） LB/amp （D） |
11．滴下した大腸菌の塗布。
| 新しい植付け用ループを使い大腸菌サンプルを広げます。ループの輪の部分を培地表面と平行に滑らせるように、手早く、プレート表面にできるだけ広い範囲に広げたら、蓋を閉めます。 |
| 操作はプレート１枚ずつ行い，新しいプレート毎に，新しいループを使用すること |
12．37℃のインキュベーターで1週間培養する。
| ラップで包んだ状態で30分程度置いておきます。その間に，培地に大腸菌がなじみます。 プレートは上下逆にして，インキュベーターにいれます。 上下逆にすることで，蓋からの菌や水滴の落下によるコンタミネーションを防ぐことができます。 |