形質転換　その２

結果(可視光線)

結果(UV照射)

結果

結果の一例を表示します。
培養条件：３７℃　培養期間：３～４日

実験を成功させるためのポイント

1. 実験前
• 形質転換用溶液（Bu），LB培地，ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ溶液は氷冷しておく。
2. 実験中
• 各操作段階で，大腸菌の状態を把握しておく。
• 植付け用ループやピペットの取り換えに注意する。
• ヒートショックの時間を厳密に計る。
• 大腸菌の状態を考え，タッピングをむやみに行わない
3. 実験後
• 使用した器具・試薬の処理を厳密に行う。
• 実験終了後は，手・机上をアルコール消毒する。

トラブルシューティング

• 白衣の着用。
• 実験前後には，手を70%エタノールで消毒する。この時実験台も拭き，それが乾いてから実験を開始する。
• チューブの持ち方，ループやピペットの取り出し方など，器具の取扱いに気をつける。
• 使用した使い捨て器具・試薬は机の上などに置かず，所定のゴミバックに入れる。大腸菌に触れなかったものは普通ゴミとして処分する。
• 皮膚や衣類が，万が一大腸菌に触れた場合は70%エタノールで殺菌して，水で洗い流す。
• 実験室の扉・窓は閉じておく。

用語解説

• DNAリガーゼ：組み込んだDNAを組み込まれたDNAと結合させる酵素。
• Green　Fluorescent　Protein：Green　Fluorescent　Protein（GFP）は生物蛍光を発するオワンクラゲ、Aequreavictoriaから単離されたタンパク質です。GFP遺伝子は最近になってクローン化されました。特徴的な構造ゆえに、紫外線を照射するとそのエネルギーを吸収し、吸収されたエネルギーは緑色のきれいな光となって放出されます。
• pGLO：GFP遺伝子とアンピシリン耐性であるβ-ラクタマ－ゼ遺伝子を含むプラスミド。
• アラビノース：甘味料の１種。バクテリアが通常食物として利用する。
• アンピシリン：抗生物質の１種。
• 形質転換用緩衝液 ：形質転換用緩衝液 （50mM　CaCl2、pH7.4）中のCa2+イオンがDNA（plasmid）の負電荷（リン酸基を持つため）を中和し、同じく負電荷を持つ、細胞膜のリン脂質との静電的反発をやわらげます。そして、DNAは細胞膜の外側から内側に通り抜けることができるのです。
• コロニー：寒天培地上で生育した、同じ遺伝子を持つ細胞の凝集塊。一つのコロニーにあるすべての細胞は同じ遺伝子を持つので、クローンと呼ばれます。
• 培地：液体や寒天（LB）培地は，バクテリアの生育をサポートする固形物質。炭水化物やアミノ酸、ヌクレオチド、無機塩類、ビタミンを含みます。
• ヒートショック：ヒートショックを与えることにより、DNAの細胞膜を通り抜ける割合が増加します。細胞の種類により異なります。
• プラスミド：細菌などに存在する主のDNAとは別のDNA。環状のDNAで、自己複製ができます。抗生物質耐性タンパク質やGFPのようなクローン化された他の生物の遺伝子を組み込むことがでます。
• ベクター：運び屋DNA。今回のプラスミドのように、他の生物からのDNA断片を組み込まれ、宿主となる細胞に導入される、自己複製するDNA分子

ピペットの説明

ピペット：使い捨てピペットは，減菌した状態で１本ずつ袋に入っている。直前に袋から出し使用する。100μL～1mLを採集できる。

ループの使い方

• 裏返して数える。
• コロニー数が多い場合，4等分(8等分)してサインペンでマークしていく。それぞれ30～50個までは数えられ，4倍(8倍)する。
• 上右端図のように全面に生えている場合は∞とする。

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